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RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是指一种高度保守的细胞机制，其中Argonaute (Ago) 家族蛋白结合小 RNA，通过小 RNA 和靶 RNA 之间的序列互补性触发较长 RNA (即靶 RNA) 的降解。RNAi 机制首次由 Andrew Z. Fire、Craig C. Mello 及其同事在线虫 (Caenorhabditis elegans) 中描述，也因此获得了 2006 年诺贝尔生理学或医学奖。
图 1. 2006 年诺贝尔生理学或医学奖授予了 RNAi 机制的发现者[1]。自发现以来，RNAi 已迅速发展成为一种强大的反向遗传学工具，用于在细胞和生物体水平上研究基因功能、调控和相互作用。在昆虫和其他动物中，已知有三类不同的小 RNA 可触发三条相应的 RNAi 途径：siRNAs、miRNAs 以及 piRNAs。本期小 M 为大家介绍 siRNA 干扰途径！ siRNA 是一种小的双链 RNA (dsRNA)，约有 20-25 个核苷酸长度，可以触发 RNA 干扰机制。长双链 RNA 在被 Dcr2 与 R2D2 或 Loqs 切割成短双链 RNA。短双链 RNA 解旋后正义链被降解。
图 2. siRNA 诱导的 RNA 干扰机制[2]。反义链与多种蛋白组分 (如 Ago2) 形成 RNA 诱导的沉默复合体 (RNA Induced Silencing Complex, RISC)。RISC 中保留的反义链与靶基因的 mRNA 特异地互补，同时 RISC 具有核酸酶活性，能将靶基因的 mRNA 切割降解，抑制靶基因的表达。 1
设计 siRNA
如果您希望设计自己的 siRNA，可根据以下原则来设计 siRNA[3][4][5]。然后，通过化学合成、体外转录、载体或 PCR 产物表达等方式进行制备相应的 siRNA。
一些在线网站可以基于一定规则设计出 siRNA 序列。如，http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html； http://sidirect2.rnai.jp/。 设计规则如下：(1) 从靶基因转录本 (mRNA) 的 AUG 起始密码子开始，寻找“AA”及之后 3'端相邻的 19 个碱基序列，作为潜在的 siRNA 靶向位点。(2) siRNA 序列的 GC 含量应为 30%-60% 左右。(3) siRNA 中应避免连续的单一碱基和反向重复序列。(4) 避免针对 5'和 3'端的非编码区 (untranslatedregions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响沉默复合体结合 mRNA， 进而影响 siRNA 的效果。(5) 将潜在的靶向位点与相应的基因组数据库 (人、小鼠、大鼠等) 进行对比，如果靶向序列与其他基因编码序列具有超过 16-17 个连续碱基对同源性，就不能选择这样的序列。我们建议使用 BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。(6) 随机设计的 siRNA 存在降低靶向基因的 mRNA 水平效果不佳的可能性，所以一个基因需要设计多个靶基因的 siRNA，通过实验确认最有效的 siRNA 序列。 2
siRNA 套装
为了满足广大研究者利用 RNA干扰的方法去探究基因功能的需求，MedChemExpress (MCE) 专门推出预设计 siRNA 套装。
我们的预设计 siRNA 套装针对靶基因 (仅限人、小鼠、大鼠) 的不同区域设计三对 siRNA，我们保证在标准使用条件下 (转染效率 80% 以上) 至少一对 siRNA 的 mRNA 水平沉默效率达 70% 以上。套装产品包括 3 对 siRNA，附赠阴性对照、阳性对照、FAM 标记阴性对照 siRNA。 Tips： MCE 提供的 siRNA 为冻干粉形式，收到产品后，请于 -20℃ 或 -80℃ 保存，可以稳定保存一年。 使用前瞬时离心，用 RNase-free H2O 或灭菌 ddH2O 配制成 20 μM 储存液。 配置 20 μM 储存液需要向 5 nmol 的 siRNA 中加入 250 μL 灭菌水。 20 μM 储存液分装保存避免反复冻融。 荧光标记的 siRNA 需要避光保存。 3
siRNA 转染
常见转染的方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE 葡聚糖和 polybrene、机械法 (例如，显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂，其中使用阳离子脂质体试剂转染是目前最常用的转染方法。MCE 推出最新转染试剂 HY-K2017 (siRNA/miRNA Transfection Reagent)，可用于高效率转染 siRNA。对于一些难转染的细胞如原代细胞、干细胞和 B 细胞系，可以考虑选择电穿孔法。
图 3. 转染实验示意图。 转染步骤如下：1. 接种细胞：待达到合适的细胞密度时进行细胞转染。2. 制备转染复合物：用无血清的培养基中稀释 siRNA 储存液和转染试剂 HY-K2017，然后混合两者，室温孵育 15-30 min。3. 转染：向细胞中加入转染复合物和无血清培养基， 可在转染约 6 h 后将无血清培养基更换为正常含血清培养基，然后培养 24-96 h 后，收样检测。4. siRNA 效果验证：常用方法是 RT-PCR 检测靶基因 mRNA 水平或 Western 检测靶基因蛋白表达水平。MCE 的预设计 siRNA 套装针提供了阴性对照、GAPDH 阳性对照、FAM 标记阴性对照。阴性对照与目的基因的序列无同源性，可用于验证 siRNA 的特异性。
图 4. 检测 siRNA 的转染效率[6]。
将 FAM 标记的 siRNA 转染 Vero 细胞。转染后第 1、2、3 天荧光显微镜检测 siRNA 的转染效率。 此外，客户可以通过检测转染了 FAM 标记阴性对照的细胞的荧光信号来确定转染效率 (图 3)。通过转染了 GAPDH 阳性对照的细胞确认转染实验中操作是否有问题。如果 GAPDH mRNA 表达降低，则证明转染实验中操作没有问题，GAPDH siRNA 正常发挥作用。如果 GAPDH mRNA 表达没有变化，则证明操作出现失误，转染失败。
▐ 1. 针对人类基因设计的 siRNA 对其他物种是否也有效？一般 siRNA 都具有物种特异性，所以针对人类基因设计的 siRNA 沉默其他物种的同源序列的效果无法保证。如果希望 siRNA 能对两个或两个以上的物种有效，这需要进行相应的生物信息学分析。▐ 2. 同样的 siRNA 为什么在细胞 A 中有效，在细胞 B 效果不好？不同细胞可能转染效率不一样，基因表达水平也不一样，这些都与 siRNA 的作用效率有关。▐ 3. 如何设计用于 RT-PCR 的引物？RT-PCR 的引物应该设计在 siRNA 靶向位点的两侧，而不是同侧。设计于同侧的 PCR 引物可能导致假阴性结果。另外，RT-PCR 结果会因为靶基因 mRNA 降解时间不同、细胞内靶基因 mRNA 丰度不同而导致假阴性结果，推荐使用多种检测方式包括 RT-PCR、Northern、Western 检测来验证 siRNA 的效果。▐ 4. 如何改善基因沉默的效果？ 提高转染效率：首先可依据转染试剂说明书进行转染条件 (细胞密度，转染试剂用量，转染时间等) 优化尝试，其次可尝试在其他细胞类型上进行转染。若由于实验模型限制无法使用其他细胞，可考虑更换转染试剂或转染方法 (如电转)。 转染过程中使用无血清培养基：血清会阻碍转染试剂与 siRNA 形成复合物，进而影响转染效果。 优化 siRNA 浓度：siRNA 最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异，这取决于 siRNA，细胞系和选择的分析方法。推荐 siRNA 工作浓度为 50 nM，也可以使用不同的浓度进行优化实验以达到最佳转染效率。但过高浓度的 siRNA 可能对细胞产生毒性。 调整细胞的生长状态：细胞生长状态不好会影响转染效率。 重新设计 siRNA：若确定转染效果尚佳，其他因素也分析没有问题的情况下，却没有达到理想的基因沉默效果，则可以尝试重新设计其他 siRNA。 ▐ 5. 为什么转染过程中细胞出现大量死亡？可能原因有： 转染试剂浓度过高会产生细胞毒性。 转染时的培养基中加入了抗生素，这会降低细胞转染的效率，甚至导致细胞死亡。 细胞本身状态不佳。 ▐ 6. 为什么检测发现靶基因的 mRNA 水平下降了但蛋白水平没有下降？一般情况下，靶基因 mRNA 的降解直接导致靶基因蛋白表达下降。但是一些情况下也可能出现 mRNA 下降水平但蛋白下降水平并没有下降。可能原因有： 真核基因表达的转录和翻译发生的时间和位置不同。可能 mRNA 的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平。所以一般建议蛋白检测的时间要稍稍推后。 某些蛋白表达量到一定的程度之后，足以满足细胞功能。转录出来的部分 mRNA 被降解，并没有参与蛋白翻译的过程。因此，mRNA 水平的下降可能没有引起蛋白水平下降。 某些基因有多个转录本，而且有可能每个转录本都会编码产生相应的蛋白。而设计的 siRNA 只是针对其中一个转录本，其他的转录本并未受影响，仍正常表达蛋白。 可能涉及到其他更加复杂的机制。 ▐ 7. MCE 的预设计 siRNA 套装可以用于动物实验吗？ 动物的体内环境复杂，实验周期长，对 siRNA 产品的稳定性提出了更高的要求。所以一般用于动物实验的 siRNA 需要做化学修饰。 MCE 的套装中的 siRNA 没有做过化学修饰，不适合用于动物实验。MCE 可以提供不同化学修饰的 siRNA 的定制服务。建议客户选择已经验证过效果的 siRNA 序列进行化学修饰，再用于动物实验。 SPP1 Human Pre-designed siRNA Set A 用于沉默 SPP1 (Human) 基因。 Sucnr1 Mouse Pre-designed siRNA Set A 用于沉默 Sucnr1 (Mouse) 基因。 Bdnf Mouse Pre-designed siRNA Set A 用于沉默 Bdnf (Mouse) 基因。 Fdx1 Rat Pre-designed siRNA Set A 用于沉默 Fdx1 (Rat) 基因。 siRNA/miRNA Transfection Reagent 一种阳离子高分子聚合物的新型转染试剂，适用于 siRNA 和 miRNA 的转染。 参考文献[1] The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach AB 2024. Tue. 2 Jul 2024. [2] Zhu KY, et al. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 2020;65:293-311. [3] Elbashir, et al. (2001) Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J 20: 6877-6888.[4] Reynolds A, et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 2004;22(3):326-330. [5] Amarzguioui M, et al. An algorithm for selection of functional siRNA sequences. Biochem Biophys Res Commun. 2004;316(4):1050-1058. [6] Jin F, et al. Silencing herpes simplex virus type 1 capsid protein encoding genes by siRNA: a promising antiviral therapeutic approach. PLoS One. 2014;9(5):e96623. Published 2014 May 2.